Ⅱ相代謝穩定性實驗原理及實驗方法

1    概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創新藥物研發的重要內容，它不僅決定了創新藥物制劑研發的成敗，而且與創新藥物研發的速度和質量有密切關系。因而，藥物代謝研究在新藥研發工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內的變化過程至關重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內和體外兩種。體內代謝法因藥物在生物體內的分布較廣，加上代謝轉化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產物在體內的濃度比較低，代謝產物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內可以得到大量的代謝產物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈”，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產物結果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單，代謝過程快，重現性好，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。

1.2 藥物代謝

藥物代謝，又稱藥物的生物轉化（biotransformation），是指藥物經過體內吸收、分布之后，在藥酶的作用下經歷化學結構變化的過程，是藥物從體內消除的主要方式之一。藥物在體內的生物轉化，分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶。UGT家族是人體內僅次于CYP450家族的第2大藥物代謝酶。UGT介導的葡萄糖醛酸結合代謝不僅會顯著影響藥物的口服生物利用度和藥物的體內藥動學過程，同時還與一些臨床藥物-藥物相互作用、藥物-草藥相互作用、藥物-食物相互作用，以及高膽紅素血癥、癌癥、自身免疫性肝炎等多種疾病的發生發展密切相關。

UGT催化的葡萄糖醛酸化代謝反應是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體將一分子的葡萄糖醛酸轉移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的結合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進而更容易被排出體外。

1.3藥物的Ⅱ相代謝

藥物的Ⅱ相代謝，又稱結合反應，是藥物在Ⅱ相代謝反應中與一些內源性的物質（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結合或經甲基化、乙酰化排出體外。藥物的結合反應，常常使其轉化為無活性的代謝物，且極性增加，以便藥物排出體外。

藥物的結合反應包括葡萄糖醛酸結合、硫酸化、乙酰化、甲基化、谷胱甘肽結合、氨基酸結合及縮合反應等。葡萄糖醛酸結合反應是體內生物轉化重要、常見的結合反應。葡萄糖醛酸基的直接供體是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）（見圖1）。

圖1 葡萄糖醛酸結合反應

葡糖醛酸基轉移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸化代謝反應是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體，將一分子的葡萄糖醛酸轉移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團的脂溶性小分子底物上，葡萄糖醛酸和小分子底物的結合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進而更容易被排出體外。

例（圖2）：

圖2α-D-UDP-葡糖醛酸和異源物的結合反應

例（圖3）：

圖3 苯甲酸的葡萄糖醛酸結合反應

一般來說，藥物先進行Ⅰ相反應進行轉化，如果極性依然較弱，則會啟動Ⅱ相反應，但有些藥物可直接進行Ⅱ相反應。

2    實驗原理

Ⅱ相代謝，又稱結合反應，指Ⅰ相代謝產物或原型藥物在酶的影響下與內源性小分子發生結合，使藥物毒性、活性降低或極性增加而易于排出的反應。在藥物的Ⅱ相代謝中，與葡萄糖醛酸的結合反應尤為常見，由微粒體中的糖醛酸轉移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）進行反應，形成葡萄糖苷酸，使其水溶性增加，易于排出體外。因此，在體外，如若加入肝微粒體和UGT系統，便可重建Ⅱ相代謝體系，從而進行Ⅱ相代謝穩定性研究。

3    肝微粒體體外溫孵法實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在體外模擬生理環境條件進行代謝反應，經過一定時間的反應后，采用HPLC、HPLC-MC和LC-MC/MC等測定溫孵液中原型藥物剩余含量或其代謝產物生成量的方法。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內質網自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，是異質性的集合體。它包含內質網膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質合成、蛋白質糖基化和脂類合成等內質網的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖4）：

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅱ相代謝穩定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模擬生理溫度及生理環境的條件下進行生化反應的體系。

推薦的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，NADPH發生系統（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂），UGT孵育系統（5 mM UDPGA，5 mM D-葡萄糖二酸-1.4-內酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒體蛋白，合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育，每個樣品平行3次，將待測物換為7-羥基香斗素，作為陽性對照， 陰性對照組分三組：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液。于預設的反應時間點，如0，5，10，15，30，60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應。

3.3 藥物代謝的檢測

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采用HPLC、HPLC-MC和LC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物的剩余含量或其代謝產物。

4    Ⅱ相代謝穩定性試劑盒簡介

本公司針對藥物代謝研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，用于Ⅱ相代謝穩定性研究的試劑盒，該產品可直接用于藥物的Ⅱ相代謝穩定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，符合Ⅱ相代謝穩定性研究試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現性好。

4.1 產品說明

本產品提供了藥物Ⅱ相代謝研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統、UGT孵育系統及其它組分，可直接用于藥物Ⅱ相代謝穩定性的研究。本產品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據實際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性高。

穩定——本試劑盒穩定性強、易于運輸和保存。

4.3 產品組成

50反應/盒，200μL/反應。

注：陽性底物為7-羥基香斗素（1mM）

4.4 產品使用說明

1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻，于37℃水浴條件下啟動代謝反應，使用秒表計時；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入終止液終止反應（如預冷乙腈，預冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

4.5 產品使用說明

1）試驗開始前，請自行準備1.5mL離心管、不同規格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2）本產品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷。

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融。

5）在使用過程中，也可根據實際實驗需求調整各組分的加入量。

6）D-葡萄糖二酸-1.4-內酯為葡萄糖醛酸結合物的水解抑制劑，可根據實際需求選擇是否加入。

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