彗星試驗(yàn)需要注意的事項(xiàng)

　　其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場(chǎng)作用下，DNA 斷片遷移出細(xì)胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場(chǎng)作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)（pH=8.4）和堿性彗星實(shí)驗(yàn)（pH＞13）。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性，可用于檢測(cè)更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

　　需要注意的是：

　　1、細(xì)胞一定要消化成單個(gè)的，如果待測(cè)的細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)的，或者形狀是圓形的，可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做，如果細(xì)胞是非圓形的，例如成纖維細(xì)胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實(shí)驗(yàn)。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。

　　2、細(xì)胞裂解：裂解條件也是一個(gè)關(guān)鍵變量，可能會(huì)干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此建議在實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準(zhǔn)備好后，應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(shí)(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。

　　3、電泳時(shí)，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)要恒定，這樣出來的慧尾才有分析價(jià)值，將載玻片隨機(jī)放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺(tái)上，使載玻片表面全部覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。

　　4、玻片準(zhǔn)備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備后，應(yīng)盡快(最好在1小時(shí)內(nèi))制備載玻片，但動(dòng)物死亡與載玻片制備之間的溫度和時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行驗(yàn)證。

　　5、掉膠的問題：蓋玻片最好兩面都涂上剝離硅烷(挺便宜的一大瓶，但是有毒)，這樣會(huì)好很多

　　6、電泳膠使用時(shí)需提前水浴融化，禁用微波，清洗玻片時(shí)注意不要直接將液體傾倒至膠面，防止脫膠。

　　7、使用組織進(jìn)行彗星試驗(yàn)時(shí)，需注意細(xì)胞制備需全程在冰上進(jìn)行，且保證在1小時(shí)內(nèi)完成鋪片。

　　8、測(cè)量方法：彗星應(yīng)該使用自動(dòng)化或半自動(dòng)化的圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量評(píng)分。用合適的熒光染色劑對(duì)載玻片進(jìn)行染色，并在配備有超熒光和適當(dāng)檢測(cè)器的顯微鏡或數(shù)碼相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)放大(如200x)的測(cè)量。