體外染色體畸變試驗原理、試驗設計及常見問題解答

第一題    染色體畸變實驗過程中閱片需要配套什么顯微鏡，如何操作？

答：染色體畸變試驗使用的是正置顯微鏡，最好在100×油鏡下進行觀察。先于低倍鏡下尋找背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相細胞，再于油鏡下進行染色體畸變觀察并記錄。

第二題    如何確定秋水仙素的濃度和處理時間？

答：若秋水仙素劑量大，則作用時間短；秋水仙素劑量小，則適當延長作用時間。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL，4h

第三題    如何根據預實驗中藥物對細胞的毒性選擇后續(xù)給藥劑量，后續(xù)給藥設置幾個濃度梯度？

答：具體難度設置需要參考所屬受試物類型的相關標準。當細胞有毒性反應時，最高濃度所產生的細胞毒性應達到約50%，最-低濃度應無細胞毒性。后續(xù)試驗應設至少3個劑量組，組距在2~√10。

第四題    低滲目的是什么？有什么注意事項？

答：在低滲環(huán)境中，細胞易吸水膨脹，染色體鋪展，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)，為后續(xù)染色做準備。在低滲過程中我們需要注意以下幾點：

（1）低滲時間。低滲時間過長，可引起細胞破裂，染色體丟失；低滲時間不足，細胞膨脹度不夠，染色體聚集，分散不好，不利于閱片。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯-化鉀溶液37℃水浴30~40min。

（2） 細胞操作需輕柔。低滲后的細胞會脹大，通透性增強，細胞操作過程一定要輕柔，以防細胞破裂。

（3）離心條件需適合。低滲后細胞膨脹，離心力過高，細胞容易破裂，導致染色體丟失；離心力過低，細胞不能沉淀，收集不到細胞。

第五題    一張撥片可觀察到200個中期分裂項嗎？如果不夠，該怎么處理？

答：大多數情況下，一張玻片很難找到200個可用于分析的中期分裂相，建議同一個劑量組多制作一些玻片，本公司一個劑量組通常會制作至少4張玻片，以保證足夠中期分裂相細胞可供分析。

第六題    低滲的溫度控制在什么范圍內？

答：低滲時可保持溫度在37℃左右，此溫度下對細胞的影響較小。

第七題    在預實驗中需要使用 s9做有活化系統(tǒng)的預實驗嗎？

答：建議在預實驗中加入S9活化系統(tǒng)進行同步檢測，判斷有或無代謝活化系統(tǒng)條件下受試物對細胞的毒性作用。

第八題    封片怎么操作？

答：長期保存玻片可使用中性樹脂膠對染色干燥后的玻片進行封裝，操作時可在玻片邊緣滴加1-2滴中性樹脂膠，再將蓋玻片沿滴加位置順壓至整個玻片，過程中保持輕柔，避免殘留氣泡或過多溢膠，以免影響后續(xù)觀察。

第九題    CHL細胞鑒定包括哪些方面？合格判定的標準是什么？

答：

（1）功能特性驗證?：細胞貼壁成纖維樣，倍增時間＜24小時；

（2）純凈度檢測?：支原體檢測，結果需陰性；

（3）染色體核型鑒定?：檢測染色體數目與結構。CHL細胞需保持核型穩(wěn)定，正常染色體數為25±2條，13條等臂染色體、12條端著絲粒染色體，自發(fā)畸變率＜5%。

第十題    細胞毒性預實驗有哪些注意事項，MTT結果可以代替嗎？

答：細胞毒性預實驗需注意同步帶上溶劑對照，并建議在染毒結束后進行鏡下記錄觀察，再采用一定方法進行量化。MTT法和CCK-8法都是比較常用的細胞毒性檢測試劑，都可用與該實驗的細胞毒性判斷。

十一題    加活化系統(tǒng)和不加活化系統(tǒng)在畸變結果上有差別嗎？差別大嗎？

答：添加代謝活化系統(tǒng)（?+S9?）與不添加（?-S9?）可能導致畸變結果的顯著差異，具體取決于受試物的代謝特性。+S9系統(tǒng)是模擬哺乳動物肝臟代謝環(huán)境，可將前體化合物轉化為活性致畸代謝物。?-S9系統(tǒng)則是直接檢測受試物本身或其穩(wěn)定代謝物的遺傳毒性。

十二題    為什么選擇CHL作為常用細胞而不選擇CHO，有哪些區(qū)別？

答：CHL和CHO細胞都是大部分指導原則內推薦使用的細胞系，而相較CHO細胞，CHL細胞的染色體數目相對穩(wěn)定，且目前大多機構使用CHL細胞較多。

十三題    閱片時看不見著絲點染色體，都成單條染色體成對出現，這是為什么哪個步驟出現了問題？

答：出現此結果的主要原因是未將細胞終止在有絲分裂中期，而是到了有絲分裂后期。可能是秋水仙素的作用時機稍晚或作用濃度過低所致，有絲分裂后期表現為著絲粒分裂，姐妹染色單體分離成獨立染色體，呈現“單條成對"向兩極移動。

十四題    CHL細胞作為實驗系統(tǒng)細胞準備時推薦的接種密度多大，接種后培養(yǎng)多久時間可以開始進行染毒？

答：本公司使用T25瓶進行試驗，接種密度為6~9×10^4/mL，接種量為5mL，即每瓶細胞量是3×10^5個~4.5×10^5個。一般情況下，接種后24h左右細胞的融合率可達到80%即可進行染毒，如果融合率不夠，也可以繼續(xù)培養(yǎng)直至滿足試驗需求。

十五題    制片過程中離心后有黑色渣渣出現，最后滴出來的片沒有染色體，但是有很多細胞圈，是什么原因？

答：有黑色渣渣出現可能原因包括

（1）細胞碎片過度堆積?：組織消化不徹-底或低滲處理時間過長（>30分鐘），導致細胞膜破裂釋放大量碎片，離心后形成黑色絮狀物。

（2）?固定劑殘留或變質?：甲醇-冰醋酸固定液比例錯誤（標準3:1）或陳舊固定液產生沉淀物，與細胞碎片結合呈黑色顆粒。

滴出來的片沒有染色體，但是有很多細胞圈的主要原因是細胞未被終止在有絲分裂中期，可能已完成細胞有絲分裂。

十六題    玻片想要長期保存，需要如何處理？

答：要長期保存玻片，需正確使用中性樹脂膠對玻片進行封裝，后續(xù)密封放置于陰涼處，可保存數年。

十七題    受試物容易析出結晶，難以溶解，最大溶解度的細胞毒性達不到50%。這種情況如何設置濃度？

答：在染色體畸變試驗中，受試物溶解性差且最大溶解度下細胞毒性不足50%時，需結合對應指導原則采取措施。當觀察到肉眼可見的沉淀時，可放棄50%細胞毒性的硬性要求。同時試驗允許使用1個含可見沉淀的濃度?，但需確保沉淀不覆蓋細胞層或干擾顯微鏡觀察；沉淀在培養(yǎng)液中分布均勻，避免局部高濃度損傷。?

十八題    請描述一下畸變類型粉碎性的染色體。

答：“粉碎性的染色體"可能由于低滲時間過久、滴片位置較高、重懸操作用力過度所致，細胞膜破裂，導致內部染色體被釋放至外部分散存在。